Ефективність низькодозового SKA-прогестерону та SKA-IL-10 в процесі модулювання запалення при ендометріозі

 In

Ефективність низькодозового  SKA-прогестерону та SKA-IL-10 в процесі модулювання запалення при ендометріозі

Francesca Mancinia, Domenico Milardia,b, Piero Carfagnac, Giuseppe Grandea,,Vincenzo Mirandad, Alessandra De Cicco Nardonec, Domenico Ricciardic, Alfredo Pontecorvia,b, Riccardo Maranaa,c, Fiorenzo De Cicco Nardone

a International Scientific Institute “Paul VI”, L.go F. Vito, 1, 00168 Rome, Italy
b Division of Endocrinology, Teaching and Research Hospital “Agostino Gemelli” Foundation, Rome, Italy
c Department of Obstetrics and Gynecology, Teaching and Research Hospital “Agostino Gemelli” Foundation, Rome, Italy
d Clinical Research Unit, GUNA S.p.a., Milan, Italy 

Інформація статті Витяг
Ключові слова: 

  • Ендометріоз 
  • Запалення 
  • Естрадіол 
  • NF-kB 
  • Низька доза
Мета: Вивчити ефективність низькодозового  SKA-прогестерону та SKA-IL-10 в процесі модулювання запалення при ендометріозі  

Моделі: Імморталізовані ендометріальні епітеліальні клітини людини (12Z), отримані від активних червоних перитонеальних уражень, імморталізовані ендометріальні стромальні клітини людини (22В), отримані від активних червоних перитонеальних уражень та імморталізованої клітинні кульури ендометрію людини T-Hesc (культура ATCC).

Методи: клітини обробляли SKA-прогестероном та SKA-IL10 у низьких дозах (10 pg / ml та 10 fg / ml відповідно). Медроксипрогестерон 17-ацетат (МПА) використовували в дозі 10 мкМ в якості еталонного лікування. 

Основні заходи: Модуляція рівнів HSD17B1 за допомогою аналізу ВБ після низьких доз SKA-прогестерону та МПА; Модуляція рівнів білка IKBα та ядерних рівнів NF-kB p65 за допомогою аналізу ВБ після низькодозового SKA- прогестерону, низькодозованого SKA-ІL10, низькодозованого SKA-прогестерону та низькодозованого SKA-ІL10 (комбіноване лікування), МПА.

Результати: Низькодозовий SKA-прогестерон був ефективним при інгібуванні експресії HSD17B1 в клітинних культурах ендометріального епітелію (12Z) та стромальних культурах (22B). Низька доза SKA-прогестерону та низька доза SKA-IL10 інгібують ядерну локалізацію NF-kB p65 та зв’язування ДНК у клітинах ендометріального епітелію (12Z), стромальних (22B) клітинних культурах та в клітинних культурах ендометрію T-Hesc. Комбіноване лікування показало додатковий ефект, а саме посилення пригнічення ядерної локалізації NF-kB p65 та зв’язування ДНК в результаті разового лікування. 

Висновок: Наші дані говорять про те, що використання комбінації низькодозового  SKA-прогестерону  та SKA-ІL-10 дають можливість для розробки нових  клінічних методів лікування ендометріозу.

 

 

  1. Введення 

Ендометріоз – це хронічне гінекологічне запальне захворювання, що характеризується наявністю функціональних залоз ендометрія та стромальних клітин поза порожниною матки [1]. Він вражає 7–10% жінок репродуктивного віку, до 50% жінок з безпліддям і до 60% жінок з дисменореєю [2]. Було встановлено, що ендометріоз є естрогенозалежним захворюванням, а резистентність до прогестерону була відмічена як механізм прогресування ендометріозу [3–6]. У здорових жінок до менопаузи основним джерелом естрадіолу (Е2) є яєчник, тоді як у жінок з ендометріозом, крім ендокринного вироблення Е2, Е2 може бути синтезований локально при ураженні ендометрію від неактивних попередників надниркових залоз, таких як дегідроепіандростерону сульфат, дегідроепіандростерон та андростендіон (А), шляхом армоматизації [7–9]. Ароматаза (CYP19A1) каталізує перетворення тестостерону яєчників або надниркових залоз (Т) в Е2, а також А в слабкий естрогенний естрон (Е1). Підвищена експресія ароматази виявлена ​​в перитонеальних, яєчникових та глибоких ендометріальних клітинах у різних джерелах [10,11]. Потім E1 може бути перетворений у E2 під дією 17β-гідроксистероїддегідрогенази типу 1 (HSD17B1), і, меншою мірою, також 17β-гідроксистероїд дегідрогеназами типу 5, 7 та 12. Кілька досліджень продемонстрували наявність або підвищення експресії HSD17β1 при ендометріозі яєчників та глибокому інфільтративному ендометріозі [11–13].

Недавні дослідження показали, що ендометріоз характеризується сильним запальним компонентом, який є одним із ключових факторів його виникнення та прогресування [14, 15]. 

Прогестини використовуються для лікування ендометріозу, оскільки прогестерон є потужним протизапальним та антипроліферативним гормоном у репродуктивному тракті жінки [16,17]. Shimizu та ін. показали, що прогестиновий диеногест (DN) знижує експресію ароматази в імморталізованих епітеліальних клітинах ендометрію людини [18]. Більше того, Fechner et al. повідомили про зниження транскрипції ароматази після ін’єкції медроксипрогестерону ацетату (МПА) та дидрогестерону (D) у мишей із імплантованим ендометрієм людини [19], що дозволяє припустити, що ці прогестини можуть регулювати локальний біосинтез естрогену при ендометріозі.

Наведено декілька літературних даних щодо участі NF-kB в патофізіології ендометріозу [20–25]. Дослідження in vitro показали посилення кодування факторів росту, прозапальних та антиапоптотичних білків, опосередкованих активацією NF-kB в клітинах ендометрію людини[26–41]. Показано, що клітини ендометрію людини активують NF-kB у відповідь на IL-1β та TNF-α in vitro [28], викликаючи послідовне посилення вироблення IL-8 [32]. 

Прогестини у фармакологічній дозі ефективні в боротьбі з ендометріозом, вони можуть’ спричинити проривні кровотечі як побічний ефект, що часто призводить до припинення терапії [45]. Крім того, оскільки медикаментозна терапія контролює, але не виліковує захворювання, можуть знадобитися тривалі періоди фармакологічного лікування. 

IL-10 відіграє значну роль у зниженні регуляції запального процесу у пацієнтів з ендометріозом [52–54], а також може забезпечити терапевтичний ефект при лікуванні ендометріозу. 

Продемонстрована роль послідовної кінетичної активації (SKA) сигнальних молекул для перорального введення в  лікуванні запального процесу [46]. Якщо є ефект в боротьбі із захворюванням, низькодозові молекули, підготовлені SKA, є варіантом для тривалого лікування пацієнтів з ендометріозом.

 Метою дослідження було оцінити ефективність низькодозового   SKA-прогестерону та IL-10 в модуляції запальної відповіді в ендометріотичних клітинних культурах. Ми провели більш ретельне дослідження, щоб оцінити ефективність низькодозового  SKA-прогестерону  (10 пг / мл) в модуляції рівнів HSD17B1 в  культурах клітин 12Z ендометріального епітелію [49] та в ендометріальних стромальних клітинних культурах 22B [49] . Крім того, ми оцінили вплив як низькодозового SKA-прогестерону  (Р), так і низькодозового SKA-ІЛ-10 (як ізольованого та комбінованого лікування) на модулювання ядерної транслокації NFkB-p65, а також можливих протизапальних та / або протиапоптотичних ефектів.

 

  1. Методи

 

2.1. Культура клітин

Імморталізовані ендометріальні епітеліальні та стромальні клітини людини (12Z та 22B відповідно) знаходились у модифікованому середовищі Дулбекко  (DMEM) / F12, доповненому 10% фетальною сироваткою великої рогатої худоби, 100 Од / мл пеніциліну G та 100 г / мл стрептоміцину (Life Technologies, Нью-Йорк, США) у зволоженій атмосфері 5% CO2–95% повітря при 37 ° C. Імморталізована клітинні культури T-Hesc  ендометрія людини ( ATCC) утримувалася в модифікованому середовищі Дулбекко (DMEM) / F12, доповненому 10% фетальною сиротою великої рогатої худоби, 1% добавкою рідких середовищ ITS (Sigma, Saint Louis, Missouri, США) ), 100 Од / мл пеніциліну G і 100 г / мл стрептоміцин (Life Technologies, NY, U.S.A.). Для експериментів із лікуванням прогестероном клітини голодували від гормонів протягом 48 год, замінюючи нормальну сироватку великої рогатої худоби плодовою сироваткою великої рогатої худоби (Life Technologies, NY, U.S.A.).

 

2.2. Реагенти

 Низькодозовий SKA-прогестерон  (GUNA-прогестерон) та низькодозовий SKA-IL10 (GUNA-INTERLEUKIN 10) були підготовлені лабораторіями GUNA (GUNA S.p.a, Мілан, Італія) за допомогою стандартизованого методу [50]. 

Препарати виготовляли з концентрацією прогестерону 10 мкг / мл і 10 фг / мл для ІЛ-10. 17-ацетат медроксипрогестерону (МПА) (Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США) застосовували в концентрації 10 мкМ.


2.3. Вестерн-блотинг аналіз 

Клітини промивали крижаним PBS та екстрагували в буфері лізису білка RIPA (50 мМ Tris – Cl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1% нонідету P- 40,0,5% Na дезоксихолату, 0,1% SDS, 1 мМ EDTA) з додаванням суміші  інгібіторів протеази (Boehringer-Germany). Концентрацію білка визначали за допомогою аналізу Бредфорда. Всі SDS – PAGE були перенесені на мембрани PVDF (Millipore). Мембрани були розроблені за допомогою посиленої хемілюмінесценції (ECLTM Amersham-UK) за допомогою системи хемілюмінесценції, Альянс 2.7 (UVITEC, Cambridge-UK) та кількісно визначені програмним забезпеченням Alliance V_1607. Були використані наступні антитіла: поліклональний кролячий анти-NFkBp65 (R & D- Міннеаполіс, США), поліклональний кролячий анти-Sp1 (Санта-Крус-Даллас, США), моноклональна мишача анти-α-тубулін (Sigma), моноклональна мишача анти-HSD17B1 (R&D), моноклональні мишачі антитіла IL10-рецептор-α (R&D), моноклональні рецептори прогестерону миші A і B (ThermoFisher-Massachusetts, США) моноклональна мишача анти-IKBalpha (ThermoFisher-Massachusetts, США), моноклональна мишача анти – Bcl2 (Dako), поліклональний кролячий анти-Bax (Dako).

 

2.4. Виділення ядерних / цитоплазматичних фракцій 

Ядерні екстракти готували наступним чином: клітини, зіскоблені з пластини PBS, ресуспендували протягом 15 хв у гіпотонічному лізисному буфері (10 мМ HEPES рН 7,9, 10 мМ KCl, 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ EGTA), додавали інгібітори протеази (Boehringer -Німеччина). Після реперфузії додавали NP-40 до кінцевої концентрації 0,6%,  протягом 15 с і ядра виділяли центрифугуванням при 10 000 об. протягом 30 с при 4 ° С. Після видалення супернатанту (тобто цитоплазматичного екстракту) ядра ресуспендували в буфері ядерного екстракту (20 мМ HEPES рН 7,9, 25% гліцерин, 0,4 М NaCl, 0,1 мМ ЕДТА, 0,1 мМ EGTA), розгойдували протягом 15 хв. при 4 ° С і потім відновлювали центрифугуванням при 14 000 об / хв протягом 5 хв при 4 ° С. 

 

2.5. Аналіз фактора транскрипції NF-kB p65 (активність зв’язування ДНК)

Свіжоприготовані ядерні екстракти клітин кількісно оцінювали за допомогою реагента Бредфорда та використовували для аналізу NF-kB p65 на фактор транскрипції, який проводили згідно з інструкцією виробника (Abcam-Cambridge-UK). 

 

2.6. Імуноаналіз IL-1β 

Рівень IL-1β вимірювали у супернатантах клітинної культури, отриманих із клітин 12Z, шляхом імуноферментного аналізу (ELISA) відповідно до інструкцій виробника (USCN Life Science Inc. та Cloud-Clone Corp.USA).

 

КАРТИНКА

Рис. 1. Низькодозовий  SKA-прогестерон інгібує естрадіол 17β-дегідрогеназу1 (HSD17B1) аналіз ВБ зазначених білків у клітинах 12Z та 22B. 

b Репрезентативний аналіз ВБ зазначених білків у клітинах 12Z, оброблених низькодозованим SKA-прогестероном (P) або контрольним  фізіологічним розчином (C). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень HSD17B1 до Тубуліну (TUB). Відношення до контрольної (С) смуги було довільно встановлено на 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів показано (* = p <0,05, двосхилий непарний t-тест). 

c Репрезентативний аналіз ВБ зазначених білків у клітинах 12Z, оброблених MPA або контрольним розчином (dmso). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень HSD17B1 до Тубуліну (TUB). Довільно встановлено відношення від контрольної групи до 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів. Показано (*** = p <0,001, двосхилий непарний тест). d ВБ-аналіз зазначених білків у клітинах 22В, оброблених низькодозованим прогестероном СКА (P) або контрольним сольовим розчином (С). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень HSD17B1 до Тубуліну (TUB). Відношення до контрольної (С) групи було довільно встановлено на 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів показано (* = p <0,05, двосхилий непарний t-тест).

 

  1. Результати 

3.1. Ефект прогестерону в низьких дозах на естрадіол 17β-дегідрогенази1 (HSD17B1) 

Експресія рецепторів прогестерону була проаналізована в ендометріотичних культурах епітеліальних клітин 12Z [49] та в ендометріотичних стромальних клітинних культурах 22B [49] методом Вестерн-Блотингу (ВБ). Клітини 12Z показали наявність обох ізоформ рецепторів прогестерону A і B, тоді як клітини 22B показали транскрипційно активну форму В (рис. 1а). 

Обробка клітин 12Z протягом 72 год низькими дозами SKA-прогестерону спричиняла значне пригнічення (21% ± 10%) білків HSD17B1 у порівнянні з контрольною групою (С) (рис. 1б). 

Двадцяти чотирьох годинне лікування з МПА отримало значне зменшення (19% ± 9%) рівня білка HSD17B1, що було подібним до лікування низькодозовим SKA-прогестероном (рис. 1в). 

Крім того, лікування клітин 22B показало порівнянну репресію рівнів білка HSD17B1 (23% ± 8%) після 6-годинної обробки (рис. 1г). 

 

3.2. Низька доза SKA-прогестерону впливає на локалізацію ядер NFkB-p65 та зв’язування ДНК 

  Вестрн-блотинг 12Z клітин, лікованих  P протягом 72 год або з МПА протягом 24 год, висвітлено на рис. 2a та b. Лікування P викликало значну, хоча і менш виражену, індукцію рівнів IKBα (17% ± 10%) порівняно з лікуванням МПА (47% ± 17%). Крім того, P-обробка 22В-клітин спричинила значне підвищення рівня білка IKBα (20% ± 13%) порівняно з контрольними клітинами (рис. 2в), що вказує на ефективність низькодозового SKA-прогестерону  в цій клітинній культурі також. 

Для перевірки специфічного ефекту низькодозового SKA-прогестерону  ми проаналізували відповідь клітинної культури ендометрію T-HESCs (ATCC). ВБ в T-HESC показав наявність обох рецепторів прогестерону A і B (Рис. S1a). Лікування прогестероном у низьких дозах викликало значну регуляцію, порівняно з ендометріотичними клітинними лініями, рівня білка IKBα (18% ± 7%) щодо контрольної групи (С) (рис. S1b), що підтримує специфічний ефект низької дози SKA-Прогестерону. Щоб переконатися, що індукція більш високих рівнів IKBα, що спостерігаються при лікуванні низькими дозами прогестерону, призводить до меншої локалізації NFkB-p65, ми провели аналіз  ядерних екстрактів клітин 12Z та 22B. Як показано на рис. 2d та e, в обох клітинних культурах спостерігалося значне зменшення ядерної локалізації p65, що становило 13% ± 6% та 16% ± 4% для клітинної культури 12Z та 22B відповідно. Отже, аналіз на коефіцієнт транскрипції фактора NF-kB, що вимірював3 активність зв’язування ДНК р65, показав значне зменшення зв’язування ДНК р65 (на 13% ± 4% та 7% ± 1% для клітинних ліній 12Z та 22B відповідно) (рис. 2f, g). Під час тестування клітинних ліній T-HESCs спостерігалося зниження на 11% ± 5% ядерної локалізації р65 (рис. S1c) та зниження на 21% ± 5% зниження активності зв’язування ДНК р65 (рис. S1d).

 

3.3. Низькодозовий SKA-IL-10 впливає на локалізацію ядер NFkB-p65 та зв’язування ДНК 

Ми підтвердили наявність рецепторів IL-10 α в клітинній культурі 12Z та 22B (рис. 3а, б). Лікування клітинних культур  12Z та 22B 10 фг / мл SKA-IL-10 (IL10) призвела до дуже значної регуляції рівня білка IKBα порівняно з контрольною групою (26% ± 15% у 12Z та 20% ± 5% у Клітини 22B) (рис. 3а, б). Як показано на рис. 3c та d в ​​обох клітинних культурах, спостерігалося значне зменшення ядерної локалізації p65, що становило 20% ± 6% та 16% ± 4% для  кожної клітинної культури 12Z та 22B відповідно. Отже, аналіз на транскрипційний фактор NFkB-p65 показав значне зменшення зв’язування ДНК р65, яке становило 13% ± 4% та 10% ± 3% для клітинних культур 12Z та 22B відповідно (рис. 3е, f).

 

3.4. Вплив комбінованого лікування низькодозованим SKA-ІЛ-10 та низькодозовим SKA-прогестероном на ядерну локалізацію NFkB-p65 та зв’язування ДНК

Лікування клітинних культур Z12 та 22B комбінацією низькодозового SKA-прогестерону та низької дози SKA-IL-10 призвело до більш високої індукції рівня білка IKBα порівняно з контрольними групами та до одноразового лікування (рис. 4а, б верхні панелі ), що відображається більшим зменшенням ядерної локалізації p65 (рис. 4, а, нижня панель).  

Тому, аналіз транскрипційного фактора NFkB-p65 показав більш значне зменшення зв’язування ДНК р65 для комбінованого лікування порівняно з контрольними клітинами та для одноразового лікування, що склало 19% ± 4% та 21% ± 8% для клітин 12Z та 22B культури відповідно (рис. 4в, г). 

 

3.5. Вплив одноразових та комбінованих методів лікування низькодозовим SKA-IL-10 та низькодозовим SKА- прогестероном на цільові гени NFkB 

Щоб встановити, чи були одноразові та комбіновані методи лікування ефективними при модуляції генів-мішеней NFkB, що беруть участь у запаленні, ми оцінюємо експресію IL-1β у супернатантах клітинних культурах, отриманих із клітин 12Z, культивованих протягом 72 год, за допомогою одноразових та комбінованих методів лікування з низькою дозою SKA IL-10 та низькодозованим SKA-прогестероном. 

Як низька доза SKA-прогестерону, так і IL-10 викликали зменшення експресії IL-1β, хоча лише прогестерон показав значне зниження (рис. 5а). Важливо, що комбіноване лікування виявилося значно ефективнішим у зниженні експресії IL-1β, ніж роздільні методи лікування (рис. 5а), що підтверджують протизапальну дію молекул.

Крім того, ми оцінюємо ефект одноразового та комбінованого лікування на модуляцію білка Bcl2, гена-мішені NFkB, що бере участь у виживанні клітин. Як показано на рис. 5b, ані моно, ані комбіноване лікування не викликали значної модуляції експресії білка Bcl2. Щоб підтвердити, що лікування не змінило шлях виживання / апоптотичний шлях 12Z клітин, ми оцінили експресію проапоптотичного білка Bax. На рис. 5b показано, що одно- або комбіновані методи лікування не суттєво змінили рівень білка Bax.

 

 

Мал. 2. Низькодозовий SKA-прогестерон знижує ядерну локалізацію NFkB p65, аналіз ВБ зазначених білків у клітинах 12Z, оброблених низькодозованим SKA-прогестероном (P) або контрольним фізіологічним розчином (C). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень IKBα до тубуліну (TUB). Відношення до контрольної (С) культури було довільно встановлено на 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів вказано (* = p <0,05, двосхилий непарний t-тест). b Репрезентативний аналіз ВБ зазначених білків у клітинах 12Z, оброблених MPA або контрольним розчином (dmso). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень IKBα до тубуліну (TUB). Довільно встановлено відношення від контрольної смуги до 1. Вказано середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів (** = p <0,01, двосхилий непарний t-тест). c аналіз ВБ зазначених білків у клітинах 22В, оброблених низькодозованим SKA-прогестероном (Р) або контрольним фізіологічним розчином (С). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень IKBα до тубуліну (TUB). Відношення до контрольної (С) культури було довільно встановлено на 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів показано (* = p <0,05, двосхилий непарний t-тест). d, e Репрезентативний аналіз ВБ зазначених білків у ядерних екстрактах клітин 12Z та 22B відповідно, оброблених низькодозованими SKA-прогестероном (P) або контрольним фізіолоічним розчином (C). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень p65 до SP1. Довільно встановлено відношення від контрольної (С) культури до 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів (* = p <0,05, ** = p <0,01, двосхилий непарний t-тест). f, g Гістограми показують зв’язування p65-ДНК (NFkB / Prot) у клітинах 12Z та 22B відповідно, оброблених низькодозованим SKA-прогестерон ом (P) або контрольним фізіологічним розчином (C) (* = p <0,05, ** = p <0,01 , двосхилий непарний t-тест).

 

 


Рис. 3. Низькодозовий SKA-IL10 знижує ядерну локалізацію NFkB p65 a, b ВБ-аналіз зазначених білків у клітинах 12Z та 22B відповідно, оброблених низькодозовим SKA-L10 (IL10) або контрольним фізіологічним розчином (C). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень IKBα до тубуліну (TUB). Відношення до контрольної смуги (С) смуги було довільно встановлено на 1. Середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів показано (*** = p <0,001, двосхилий непарний t-тест). c, d Репрезентативний аналіз ВБ зазначених білків у ядерних екстрактах клітин 12Z та 22B відповідно, оброблених низькодозованим SKA-L10 (IL10) або контрольним фізіологічним розчином (C). Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень p65 до SP1. Довільно встановлено відношення від контрольної (С) культури до 1. Вказано середнє ± SD трьох незалежних біологічних повторів (** = р <0,01, двосхилий непарний t-тест). e, f Гістограми показують зв’язування p65-ДНК (NFkB / Prot) у клітинах 12Z та 22B відповідно, оброблених низькодозованим SKA IL10 (IL10) або контрольним фізіологічним розчином (C) (* = p <0,05, ** = p <0,01 , двосхилий непарний t-тест).

 

  1. Обговорення 

Гормони та цитокіни при наднизькій концентрації діють як “сигнальні молекули”, які здатні здійснювати імунно-ендокринну модуляцію. Ефективність перорально введених цитокінів та інших пептидних молекул підтверджується даними, повідомленими в науковій літературі, однак їх низька біодоступність являє собою основну проблему цього шляху введення [51]. Нещодавно був запропонований новий підхід до використання сигнальних молекул у терапії. Він заснований на застосуванні низьких доз цитокінів, антитіл, нейромедіаторів та гормонів, використовуючи інноваційну фармацевтичну технологію під назвою Послідовна Кінетична Активація ( SKA), система доставки лікарських засобів (кодифікована та стандартизована GUNA Spa, Італія), яка дозволяє активувати наноконцентрації навіть нижче, ніж встановлена мінімальна ефективна доза з терапевтичним ефектом,  у порівнянні з результатами, викликаними високими концентраціями. Ця стратегія є  основою низькодозової медицини.

Механізм дії цитокінів, гормонів, нейропептидів та факторів росту  в низьких дозах при SKA полягає в модуляції механізму внутрішньоклітинної транскрипції внаслідок їх низької концентрації між гормонами та 10–15 г / мл (мкг / мл) та 10–15 г / мл (fg / ml) для інших молекулярних месенджерів[52,53,54]. 

У цьому дослідженні ми вперше підтвердили підхід «низькодозової медицини » для можливого майбутнього лікування ендометріозу. Зокрема, ми вивчали в моделі in vitro вплив низькодозового SKA-прогестерон у та IL-10 на модуляцію процесів, що беруть участь у синтезі естрадіолу та в опосередкованому NFkB запаленні, пов’язаному з ендометриозом.

Низькодозований прогестерон  був ефективним в ендометріотичних, епітеліальних та стромальних клітинних культурах в модуляції експресії HSD17B1. Після 72 годин лікування низькодозованим SKA-прогестероном, ми повідомили про зниження рівня білка HSD17B1 на 21% відносно контрольної групи. Цей результат є подібним до ефекту, який спостерігався після лікування фармакологічними дозами MПА (19%), хоча він спостерігався пізніше (72 vs 24 год). 

Необхідно провести подальші дослідження для підтвердження клінічної ефективності низькодозового SKA-прогестерону порівняно із синтетичним прогестином у високій дозі при лікуванні симптомів, пов’язаних із запальним процесом при ендометріозі. Наші дані in vitro підкреслюють однакову ефективність двох методів лікування. Крім того, ми продемонстрували, що низькодозований SKA-прогестерон пригнічує ядерну локалізацію NFkB-p65 та зв’язування ДНК у клітинних культурах ендометріотичного епітелію та строми. Важливо, що ми також показали, що низька доза SKA-прогестерону значно знижує секрецію IL-1β у клітинах 12Z, підтверджуючи його протизапальну дію. 

Крім того, наші результати демонструють ефективність низькодозового СКА IL10 в інгібуванні ядерної локалізації NFkB-p65 та зв’язуванні ДНК в культурах ендометріотичного епітелію та стромальних клітин, що підтверджує модулюючу дію низькодозових  SKA-інтерлейкінів  [54]. Крім того, ми показали, що низька доза SKA IL10 знижує секрецію IL-1β у клітинах 12Z. Ці дані відкривають можливість використання низької дози SKA- ІЛ-10 у терапії ендометріозу з метою зменшення запального хронічного запалення, пов’язаного з цією патологією. Важливо, що наші дані свідчать про те, що комбіноване лікування надає  довготривалий ефект, оскільки збільшує гальмування ядерної локалізації рівня NFkB-p65, зв’язування ДНК та рівня IL-1β порівняно з разовими методами лікування. Наші дані показали також, що ні моно-, ні комбіноване лікування не викликали значної модуляції експресії білка Bcl2 та Bax, таким чином, дозволяючи припустити, що низькодозований SKA-IL-10 та прогестерон діють на запальний процес, керований NFkB, а не на апоптотичний шлях, принаймні в цей момент часу. В цілому ці дані відкривають можливість використання комбінації низькодозового SKA-прогестерону та IL-10 у терапії ендометріозу, що додатково зменшує запальний процес, пов’язаний з цією патологією. На закінчення, наші дані показують, що використання комбінації низькодозового SKA-прогестерону та IL-10 може стати нагодою для розробки нових клінічних досліджень для оцінки ефективності та безпеки молекул, протестованих для подальшого лікування ендометріозу.

 

 

Рис. 4. Поєднання низькодозового SKA-прогестерону (P) та IL10 зменшує ядерну локалізацію NFkB p65 a, b ВБ-аналіз зазначених білків у клітинах 12Z та 22B відповідно обробляють, як зазначено. Гістограма на правій панелі показує відношення денситометричних значень IKBα до тубуліну (TUB) (загальні екстракти білків) та p65 до SP1 (екстракти ядерних білків). Відношення до контрольної (С) культури було довільно встановлено на 1. Показано засоби двох незалежних біологічних повторів. c, d Гістограми показують зв’язування p65-ДНК (NFkB / Prot) у клітинах 12Z та 22B відповідно, оброблених як зазначено (* = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001, двосхилий непарний t – тест).

 

Подяка Автори дякують Клавдії Менальдіно (Нью-Йорк, США) та Естер Махоні (Кардіфф, Великобританія) за їх ретельне редагування англійською мовою.

 

 

Рис. 5. Одноразові та комбіновані методи лікування низькодозованими ІК-10 СКА та низькодозованими SKA-прогестероном на генах-мішенах NFkB. Гістограма показує рівні IL-1β, виміряні у супернатантах 12Z клітин, оброблених як зазначено протягом 72 год (* = p <0,05, двопальцевий непарний t-тест). b ВБ-аналіз зазначених білків у клітинах 12Z, які обробляли, як зазначено протягом 72 год. Гістограми на правих панелях показують відношення денситометричних значень Bcl2 або Bax до Тубуліну (TUB). Відношення від контрольної (С) культури було довільно встановлено на 1. Показано засоби двох незалежних біологічних повторів.