Наднизькі дози фолікулостимулюючого гормону та прогестерону зменшують тяжкість прояву синдрому полікістозних яєчників

 In

Наднизькі дози фолікулостимулюючого гормону та прогестерону зменшують тяжкість прояву синдрому полікістозних яєчників на моделі гіперандрогенізованих піддослідних мишей

Irene Tessaro,1,2 Silvia Modina,1,3 Valentina Lodde,1 Giulia Sivelli,1 Federica Franciosi,1 Laura Terzaghi,1Patrizia Luchini,4 Cristiano Rumio,3,4 and Alberto Maria Luciano1,3,* 

Вступ

Синдром полікістозних яєчників (СПКЯ) – це широко розповсюджене репродуктивне порушення, що проявляється гіперандрогенізмом, полікістозом яєчників та ановуляцією (1). Коли нормальна функція яєчників порушена, це призводить до множинних дрібних кіст (2, 3).  Помірно поширеною обставиною при СПКЯ є посилена  інтенсивність утворення гонадотліберину, що призводить до надлишку лютеїнізуючого гормону (ЛГ) над фолікулостимулюючим гормоном (ФСГ) (4, 5).
Це ендокринологічне порушення може бути пов’язане з порушенням гіпоталамічної чутливості до Р4 (6). Підвищений ЛГ сприяє виробленню андрогенів тека-клітинами, натомість відносний дефіцит ФСГ порушує ароматизацію андрогенів до естрогенів гранульозними клітинами та  погіршує дозрівання фолікулів і овуляцію (7).

Крім того, у 60–80% хворих на СПКЯ розвивається інсулінова резистентність, що може призводити до надлишку інсуліну в яєчниках, а це, в свою чергу, може підвищити чутливість тека-клітин до ЛГ, збільшуючи продукцію андрогенів(8, 9 ). Таким чином, створюється “порочне коло” надлишкової екскреції андрогенів.

Лікування хворих на СПКЯ зазвичай сконцентроване на симптомах,  що пов’язані з розладами менструального циклу, андроген-залежними порушеннями, безпліддям (10). Стимуляція яєчників гонадотропінами – один з методів терапії для хворих на СПКЯ із безпліддям; однак через велику кількість малих антральних фолікулів, чутливих до ФСГ (11), жінки з СПКЯ мають більший ризик багатоплідної вагітності та синдрому гіперстимуляції яєчників (СГСЯ; (12)) у відповідь на лікування ФСГ (13). Для мінімізації можливих ризиків запропоновано протоколи лікування ФСГ у низьких дозах (14). Тим не менш, одностайність щодо лікування безпліддя у випадку СПКЯ (15, 16), була заснована на тому, що хоча протоколи ФСГ з низькою дозою є ефективними для досягнення овуляції, необхідно додатково контролювати дози ФСГ згідно з протоколами. У цій ситуації було запропоновано ультранизьку дозу ФСГ, чим було досягнуто значних клінічних результатів (17) та закріплено нинішній інтерес до розробки нового протоколу з високим рівнем безпеки застосування.

 

Піддослідні тварині, що мають СПКЯ, могли б полегшити  процес дослідження, завдяки чому можна зрозуміти як патогенез, так і до виявити нові та ефективніші методи лікування. Гризуни, що були ліковані андрогеном, часто використовуються як піддослідні моделі для вивчення репродуктивного та метаболічного дефіциту при СПКЯ(18–20). Використовуючи  в експерименті гіперандрогенізованих дигідроепіандростероном (ДГЕА) мишей було встановлено, що пероральне введення тижневої дози ФСГ в низьких дозах з покроковим контролем за протоколом може покращити деякі прояви СПКЯ у піддослідних мишей(21), за рахуного чого можна впровадити новий і більш зручний терапевтичний підхід. Враховуючи ці результати, метою дослідження було оцінити ендокринні та морфологічні ефекти комбінації наднизьких доз ФСГ та Р4, перорально введених піддослідній тварині. Оскільки активація є одним із процесів підвищення ефективності фармацевтичних препаратів (22, 23), також було випробувано ефект послідовної кінетичної активації (СКА) введених гормонів.

 

Методи

За винятком конкретно зазначених, усі хімічні речовини були придбані у компанії Sigma Chemical Company (Сент-Луїс, штат Міссісі, США).

 

Тварини

Миші-самки Бальб / с (Mus musculus; штам коду: 028; що не має специфічних патогенів; (Charles River Laboratories Italia s.r.l., Calco (LC), Італія)), були розміщені групами по чотири, їм було дано дванадцять днів з метою акліматизації до житлових умов. Умови навколишнього середовища були такими:  температура повітря 21 ± 2 ° C, вологість 50% ± 10% та чургуванням день/ніч   світло/темрява12:12. Тварин помістили в клітки розмірами 160 × 270 × 370 мм (Д × Ш × В) і годували ad libitum???? стандартною гранульованою дієтою (стандартна мишача дієта 4RF18, Mucedola srl, Мілан, Італія) та очищеною водою.  Проводився моніторинг стану тварин двічі на день з метою контролю стану здоров’я. Непередбачуваних подій/поведінкових реакцій не спостерігалося. Усі процедури проводились у стандартних та сертифікованих установах по догляду за тваринами Міланського університету. Протокол експериментів був затверджений Комітетом з етики Міланського університету відповідно до Європейської директиви 2010/63 / ЄС, що переглядає Директиву 86/609 / ЄЕС про захист тварин,яких було використано в наукових цілях. Усі розділи цього звіту видповідають головним принципам ARRIVE щодо звітування про дослідження тварин (24).

 

Гіперандрогенізація та гормональне лікування:

Всі експерименти проводили на мишах 40 днів, як було описано раніше (21).

Гіперандрогенізовані миші щодня отримували підшкірну ін’єкцію ДГЕА (1,2 мг / мишу / добу, отриманої з 6 мг / 100 г маси тіла (25)), розчиненої в 0,1 мл кунжутного масла протягом 20 днів поспіль. Для вивчення впливу перорального прийому ФСГ та P4 на тварин, з ознаками СПКЯ, використовували чотири групи по вісім мишей (табл. 1), аналогічно до попереднього дослідження (21). Тридцять дві миші були випадковим чином розподілені у чотири групи (вісім тварин на групу). Згідно з попередніми знаннями про активовані суміші (22, 23), розчини гормонів у наднизьких дозах готували у двох різних складах: активований розчин (ФСГP4), ініційований стандартизованим методом фармацевтичного препарату, відомим як SKA (GUNA Spa, Мілан , Італія) та неактивований розчин (). Активовані розчини струшувались, базуючись на таких параметрах: вертикальне струшування; 10 сантиметрів діапазону руху; швидкість струшування відповідає 100 коливань за 10 секунд (26, 27).

 

Таблиця 1 

Експериментальна модель

 

Лікування п/ш ін’єкції (загальний об’єм 0.1 мл) Пероральні призначення (загальний об’єм 0.1 мл)
CTRL Кунжутна олія  фізіологічний розчний
DHEA DHEA (1.2 мг) фізтологічний розчний
DHEA+FSHP4 DHEA (1.2 мг) Активований ФСГ (0.44 pg)+ активований P4 (0.44 pg)
DHEA+NA-FSHP4 DHEA (1.2 мг) неактивований ФСГ (0.44 pg)+неактивований P4 (0.44 pg)

 

Тому одночасно з ДГЕА лікуванням кожна миша першої групи (ФСГP4) отримувала щодня 0,44 пг активованого ФСГ плюс 0,44 пг активованого P4, що відповідає 1,17 × 107 молекул ФСГ та 8,42 × 108 молекул P4. В загальному обсязі 0,1 мл фізіологічного розчину, що вводиться безпосередньо в шлунок перорально один раз на добу протягом 20 днів поспіль. Кожна миша другої групи (NA-ФСГP4) отримувала щодня 0,44 пг неактивованого ФСГ плюс 0,44 пг неактивованого Р4 в загальному обсязі 0,1 мл фізіологічного розчину перорально, як описано раніше. Третій групі (ДГЕА) вводили ДГЕА підшкірно на фізіологічному розчиі перорально. Останній групі щодня вводилось кунжутне масло підшкірно та 0,1 мл фізіологічного розчину перорально; також була відведена група для контролю (CTRL). Підшкірні ін’єкції, одразу після перорального введення медикаментів, робили щодня о 14:00, в межах одних умов навколишнього середовища/клітки. Надалі мишей лікували так само. Масу тіла тварин вимірювали на початку та наприкінці 20-денного лікування. 

 

Гормональний аналіз сироватки (крові):

Після закінчення лікування проводився забір крові у кожної миші, сироватку відокремлювали та проводили аналіз даних, як було описано раніше (21). Загалом, кількісне визначення тестостерону (Т) проводили методом імуноферментного аналізу на інгібіторний фермент (Мишачий тестостерон ELISA Kit, CSB-E05101 м, Китай), тоді як рівні P4, естрадіолу (E2) та LH вимірювали за допомогою магнітного імуноферментного аналізу на основі Luminex Мультиплексної системи (Merck Millipore, Німеччина), згідно з інструкціями виробника; відповідно, P4 та E2 були проаналізовані за допомогою “стероїдної / щитоподібної магнітної панелі гормонів” (# STTHMAG-21K), а “Магнітна панель гіпофіза миші” (# MPTMAG-49K) була використана для ЛГ.

 

Морфологічна оцінка яєчників:

Яєчники забирали одразу після смерті мишей і фіксували у 10% нейтральному буферному формаліні (Bio-Optica, Мілан, Італія) на ніч. Яєчники обробляли і послідовно секціонували, як описано раніше (21). Загалом, зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (DDK Italia, Vigevano, Італія) і, нарешті, аналізували методом світлової мікроскопії для оцінки діаметра фолікулів та морфологічних особливостей (28). Для відбору репрезентативної фолікулярної популяції розглядали один шматочок через кожних 150 мкм, який використовували для ідентифікації антральних фолікулів, які підлягають аналізу. Діаметр фолікула обчислювали як середню відстань між протилежними ділянками базальної мембрани, тоді як товщину стінки обчислювали як суму внутрішніх шарів тека-клітин та гранульозних клітин. Відповідно до діаметрів фолікулів,  фолікулярна популяція була розділена на два класи: ранні малі антральні фолікули (150–300 мкм) та великі антральні фолікули (> 300 мкм) (29–31). Для кожного антрального фолікула реєстрували наявність морфологічних кістозних ознак (32-36).  Незалежний морфологічний аналіз був проведений двома дослідниками.

 

Імуноекспресія цитохрому P450 ароматази:

Експресію цитохром Р450 ароматази ( Р450) оцінювали методами імуногістохімії, як було описано раніше (21). Отже, білок виявлявся методом інкубації з козлячими анти-CYP19, 4 пг/мл, і потім з пофарбованими барвником Alexa Flour 448 анти-козлячими IgG кроликів. Негативний контроль проводився шляхом виключення первинних антитіл. Ядра були пофарбовані I pg/ml 4,6- diamidino-2-Dhenvlindole (DAPI) і фоліккли аналізували за допомогою єпіфлюортсцентної мікроскопії зі збільшенням в 200-400 раз.


Статистичний аналіз:

Статистичний аналіз проводили за допомогою Prism GraphPad (GraphPad Software, версія 6.0f, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Кожну тварину розглядали як експериментальну одиницю. Всі тварини (тридцять дві миші)тесувалися під час всього експерименту. Дані аналізували за допомогою однобічної ANOVA з наступним тестом багаторазового порівняння Фішера (LSD). Незалежно від тесту, значення р <0,05 вважалися об’єктивними. 

 

Результати

Зміни маси тіла

Вплив гормональних процедур на масу тіла оцінювали шляхом зважування мишей. До початку лікування вага тварин статистично не відрізнявся між групами (табл. 2). Миші набирали вагу під час експерименту, але тварини, ліковані ДГЕА, набрали приблизно на 10% більше, ніж контрольна група (табл. 2).

 

Вплив різних гормональних методів лікування на масу тіла мишей

 

Лікування Вага (гр) у 0 день Вага (гр) у 21 день
CTRL 15.5±0.42a 19.38±0.37b 
DHEA 16.63±0.46a  21.38±0.37c 
DHEA+FSHP4 16.75±0.41a  22.13±0.48c 
DHEA+NA-FSHP4 15.75±0.67a  21.13±0.81c 

 

Дані виражали як середнє значення ± SEM і аналізували за допомогою однобічного ANOVA, після чого проводили тест багаторазового порівняння (Фішера ); різні літери вказують на значні відмінності між групами (p <0,05).

Гормональний аналіз: 

Ефект введення наднизьких доз ФСГ та Р4 на сироваткові гормональні профілі оцінювали за допомогою методів імуноферментного аналізу, а результати на разі зведені в таблиці 3. Концентрація тестостерону та Р4 була статистично вище у всіх тварин, з індукованим СПКЯ (ДГЕА), порівняно з контрольною групою. Не спостерігалося відмінностей у тварин, які отримували ФСГ та P4. Лікування DHEA значно збільшило концентрацію E2 у сироватці крові порівняно з контрольною групою, і обидва методи лікування FSHP4 та NA-FSHP4 відновили рівень E2 статистично подібний до контрольної групи. ДГЕА самостійно або з FSHP4 викликала значне зниження концентрації ЛГ порівняно з контрольною групою.

 

Таблиця 3 

Вплив різних гормональних методів лікування на концентрацію тестостерону (Т), прогестерону (Р4), естрадіолу (Е2) та концентрації лютеїнізуючого гормону (ЛГ) у сироватці крові

 

Лікування Тестостерон (нг/мл) Р4 (нг/мл) Е2 (нг/мл) ЛГ(нг/мл)
CTRL 0.21±0.01а 12.75±3.09a 1.43±0.15a 0.53±0.06a
DHEA 0.89±0.14b 37.1±3.72b
2.53±0.24b 0.19±0.02b
DHEA+FSHP4 0.92±0.2b 30.45±3.44b 1.65±0.21b 0.15±0.01b
DHEA+NA-FSHP4 0.84±0.13b 36.51±3.62b 1.36±0.1b 0.16±0.01b

Дані виражали як середнє значення ± SEM і аналізували за допомогою однобічного ANOVA, після чого проводили тест багаторазового порівняння (Фішера ); різні літери вказують на значні відмінності між групами (p <0,05).

Морфологічна оцінка яєчників:

Потенційну роль перорального введення наднизьких доз ФСГ та Р4 на  розвиток фолікулів у тварин, яким було призначено ДГЕА, оцінювали шляхом моніторингу фолікулів, діаметром 150–300 мкм та більше 300 мкм у діаметрі. Лікування ДГЕА значно зменшило кількість мілких фолікулів у яєчнику, навіть якщо і FSHP4, і NA-FSHP4 послаблювали дію ДГЕА (табл. 4). З іншого боку, ДГЕА збільшила кількість великих фолікулів у яєчнику, і обидва препарати FSHP4 можуть послабдювати ефект ДГЕА,  незначно зменшивши кількість великих фолікулів. (табл. 4).

 

Таблиця 4

Вплив різних методів гормонального лікування на товщину стінки, на кількість антральних фолікулів у яєчнику та відсоток кістозних / атретичних фолікулів

Лікування Товщина  стінки К-ть фолікулів /яєчник Відсоток Кістозних фолікулів
Малі фолікули (150-300 мкм) Великі фолікули

(>300 мкм)

Малі фолікули (150-300 мкм) Великі фолікули

(>300 мкм)

Малі фолікули (150-300 мкм) Великі фолікули

(>300 мкм)

CTRL 28.83±1.32  64.87±4.71a 12.63±1.18a  0.75±0.36a 26.82±5.66 0.25±0.16a 
DHEA 32.21±2.14  47.06±2.18b 6.37±1.4 7.62±1.13 39.05±13.14  67.23±3.04b 
DHEA+FSHP4 33.32±2.7  47.39±1.75b 10.25±0.99ab  5.5±0.84 b 24.11±6.79  42.76±6.01c 
DHEA+NA- FSHP4 28.77±1.41  50.44±2.25b 9.37±1.8ab 5.1±0.85b  16.67±5.32  34.06±9.41c 

 

Дані виражали як середнє значення ± SEM і аналізували за допомогою однобічного ANOVA, після чого проводили тест багаторазового порівняння (Фішера ); різні літери вказують на значні відмінності між групами (p <0,05).

У великих фолікулах (> 300 мкм) лікування ДГЕА викликало зменшення товщини шарів тека-клітин та гранульозних клітин, незалежно від інших гормональних методів (табл. 4). У малих фолікулах відмінностей не спостерігалося (150–300 мкм). 

Описано особливості атрезії фолікулів та кістозних утворень (рис. 1): клітинний пікноз, переривання базальної мембрани та розрив шарів тека-клітин, зменшення кількості шарів у гранульозних клітинах, наявність подовжених епітеліоїдних клітин на поверхні, що вистилає стінку фолікула. також спостерігалося вторгнення клітин крові та макрофагів у стінку фолікула, а також у кістозну рідину (мал. 1). ДГЕА значно збільшила частоту морфологічних кістозних ознак у антральних фолікулах діаметром> 300 мкм у яєчнику (табл. 4); однак пероральне введення активованого чи не активованого розчину ФСГ та P4 знижувало відсоток атретичних / кістозних ознак у великих фолікулах мишей,  що були проліковані ДГЕА, навіть якщо їх кількість все ще перевищувала контрольну групу. Нарешті, у популяції фолікулів 150–300 мкм пероральне введення FSHP4 та NA-FSHP4 зменшило відсоток атретичних / кістозних фолікулів у загальному порівнянні з популяцією, фолікули якої було проліковано ДГЕА. (табл. 4).

 

 

КАРТИНКА

Вплив різного гормонального лікування на відсоток фолікулів, що мають атретичні / кістозні ознаки.

 Описові зображення своєрідних морфологічних змін в антральних фолікулярних стінках яєчників, виділених з контрольної групи (A, D), порівняно з мишами, пролікованими ДГЕА(B, C, E, F), забарвлені гематоксиліном та еозином. У контрольній групі (A, D) зовнішні, внутрішні шари, базальна мембрана та гранульозні шари тека-клітин клітин здаються нормальними. Кістозні ознаки описуються за рахунок наявності сферичних пікнотичних ядер (В), втрати стінової архітектури гранульозними клітинами (В і Е, білі стрілки), виснаженням базальної мембрани (В і Е, зірочки), макрофагами в кістозній рідині (В і Ж , червоні стрілки), тонкими та витягнутими епітеліоїдними клітинами на внутрішній поверхні стінки (C і F, чорні стрілки) та відновленням шарів гранульозних клітин (C). Прутки = 50 мкм


Локалізація ароматазного цитохрому Р450: 

Сигнал про (наявність)  P450 завжди відсутній або слабкий у 150–300 мкм  у ранніх малих антральних фолікулах, незалежно від лікування (рис. 2), тоді як він був наявний у цитоплазмі гранульозних клітин у великих антральних фолікулах (> 300 мкм). Зокрема, P450 сконцентровувався всередині цитоплазми муральних клітин, що лежать на базальній мембрані (мал. 2), з мізерним або відсутнім забарвленням у (сumulus) клітинах. Сигналів у контрольних секціях не спостерігалось.

 

Імуногістохімічна локалізація ароматази цитохрому Р450.

Слабкого, або ж зовсім ніякого, ароматазного білка не було помічено у ранніх малих антральних фолікулах (150–300 мкм; зліва), оскільки позитивне фарбування було помітне у великих антральних фолікулах (> 300 мкм; посередині). Контрольні зразки не виявляли позитивного фарбування (праворуч). Шкала оцінки = 50 мкм

 

Обговорення

СПКЯ – найпоширеніша ендокринопатія серед жінок репродуктивного віку (37). Його висока захворюваність привернула значну увагу населення (> 1,5 × 106 сайтів, присвячених синдрому (38)). Крім того, за оцінками, ідентифікація та лікування СПКЯ щорічно коштуватиме 4 мільярди доларів лише системі охорони здоров’я США (39). Подібних даних, доступних для Європи, немає. Незважаючи на поширеність, не існує згоди щодо довготривалого ведення жінок із СПКЯ  звичайними фармакологічними методами лікування, орієнтованими на симптоми, а також часто спостерігаються побічні ефекти. Тому потреба в ефективному лікуванні СПКЯ провокує розповсюдження дослідницьких/наукових експерименів/досліджень щодо інноваційних підходів, що відповідають традиційному медичному лікуванню синдрому(40). У цьому контексті дані результати підтверджують і розширюють наші попередні висновки щодо перорального введення низьких доз ФСГ (21).

Це дослідження демонструє, що наднизькі дози можуть покращити декілька аспектів, пов’язаних з гіперандрогенією, в піддослідних мишей із СПКЯ. Фактично введення комбінації гормонів відновило рівень фізіологічного рівня естрадіолу в сироватці крові та зменшило відсоток кістозних фолікулів. Однак позитивні ефекти гормонального лікування спостерігалися незалежно від протоколу SКА.

Інтерес до активованих сумішей зростає в різних галузях, переважно у фармацевтичній технології, хоча механізм, що лежить в основі ефективності, досі невідомий. Щоб перевірити внесок у процес активації, ефект активованого та неактивованого препарату був проаналізований у таких самих експериментальних умовах. Хоча інші автори виявили, що протокол активації сильно підвищує ефективність активованих розчинів (26, 27, 41–43), наші дані показали, що немає розбіжностей щодо розглянутих параметрів між активованим SKA та неактивованим препаратом.

У відповідності з літературою та нашою попередньою роботою, представлені результати підтвердил, що піддослідні миші, ліковані ДЕГА, як відповідна модель для вивчення синдрому СПКЯ, повторюють найбільш поширені клінічні особливості цього репродуктивного розладу (44). Більшість піддослідних тварин використовувались для індукції гіперандрогенії, особливо при застосуванні ДГЕА,  по типу андрогену, що часто збільшується у жінок із СПКЯ (45). Доза, яка зазвичай використовувалась мишам (6 мг / 100 г маси тіла), провокує безпліддя та утворення фолікулярних кіст в яєчниках (46–48). Як було зазначено раніше (21), лікування ДГЕА збільшувало вагу тварин та концентрацію стероїдних гормонів у сироватці крові  в залежності від індукції цистогенезу. Незважаючи на те, що надлишок ЛГ є однією з особливостей у жінок з СПКЯ (6), у цих експериментах було підтверджено зниження кількості ЛГ у сироватці крові піддослідних мишей,  лікованих ДЕГА, як було описано раніше.

Введення гонадотропіну широко застосовувалося для індукції овуляції у пацієнтів із СПКЯ, проте в якості побічних ефектів відзначився розвиток побічних фолікулів і багатоплідна вагітність (49). Через соціальні та медичні аспекти багаторазової гестації було створено реалізацію програм лікування низькими дозами. Тим не менш, за попередніми протокоами лікування безпліддя,  спровокованого СПКЯ (15), дійшли висновку, що хоча протоколи лікування ФСГ  низькою дозою є ефективними для досягнення овуляції у  таких жінок, подальші вдосконалення мають важливе значення для гарантування безпеки цієї інноваційної методики.

 

У цій роботі запропоновано лікування мишей іх СПКЯ, з дуже високим розведенням ФСГ та P4. Тому вводили 0,44 пг ФСГ, що значно нижче дози, яка зазвичай застосовується в клінічній терапії низькими дозами для ановуляторного безпліддя (50 МО у жінок, перерахованих за середньою масою 0,02 МО у миші, що відповідає 2 нг ).

Ультрамалу дозу ФСГ щодня вводили одночасно до Р4. Цей гормон часто використовували, як підтримку лютеїнової фази при індукції овуляції. Як було сказано раніше, ендокринологічні розлади, які призводять до аномального розвитку фолікулів та ановуляції у хворих на СПКЯ, можуть бути пов’язані з порушенням гіпоталамічної чутливості до Р4 (6). Гранульозні клітини жінок із СПКЯ виявляються некомпетентними до фізіологічної секреції Р4 після лютеїнізації, якщо досягається овуляція (50). Отже, жінки, які страждають на СПКЯ, загалом можуть отримати користь від прийому Р4 в лютеїновій фазі (51). Прийом прогестерону зменшує частоту викиду ЛГ (52), це досліджено під час лютеїнової фази в циклах овуляції.(53). Прогестерон також може чинити різноманітні сприятливі ефекти для жінок із СПКЯ, у яких часто виявляють затримку розвитку ендометрію (54, 55). Окрім загальних заходів обмеження епітеліальної проліферативної дії естрогенів та індукування децидуалізації, P4 знижує регуляцію рецепторів андрогенів ендометрію, експресія яких підвищена у жінок із СПКЯ (56). У клінічній практиці Р4 зазвичай вводять вагінально в концентрації 200 мг двічі на день (51). Наші дані свідчать про те, що пероральне введення наднизької дози Р4 (0,44 пг ) могло б сприяти відновленню декількох особливостей СПКЯ у нашій моделі. Однак під час цих досліджень стало відомо, що одночасне введення P4 та ФСГ послаблювало деякі ознаки СПКЯ у гіперандрогенізованій моделі  піддослідної миші на аналогічнму етапі попереднього дослідження, де низька доза ФСГ вводилася окремо (21). З цієї причини необхідні подальші дослідження для кращого визначення конкретної ролі P4 у пом’якшенні вираженості фенотипу СПКЯ у піддослідних мишей.

По-перше, призначення ФСГP4 відновилює рівень E2 у сироватці крові. Це явище відображає функціональність гранульозних клітин, оскільки гранульозні клітини ановуляторних жінок із СПКЯ секретують Е2 інтенсивніше , порівняно з фолікулами зі збільшеними розмірами у нормальних яєчників (57). Підвищення концентрації Е2 показало посилення процесів атрезії фолікулів у тварин, які отримували ДГЕА, тоді як пероральне лікування ультранизькими дозами ФСГ та Р4 дозволило знизити концентрацію Е2 (табл. 3). Це зниження, ймовірно, відображає часткову нормалізацію розвитку фолікулів; одночасно яєчники, які лікували як FSHP4, так і NA-FSHP4, показали зниження атретичного та кістозного стану як в зростаючих, так і у великих антральних фолікулах, а тим часом – розвиток нової кількості малих зростаючих здорових фолікулів, які синтезують та виділяють менше E2 (58, 59) (Таблиця 4). Цю гіпотезу підтверджує імуногістохімічне дослідження, яке наголошує на відсутності P450 у клітинах малих фолікулів, на відміну від великих фолікулів. Таким чином, спостерігається значне зниження рівня концентрації Е2 у тварин, які отримували ФСГP4, пов’язане зі зменшенням кількості великих антральних фолікулів, типово виражених ароматазою.

Крім того, у нашому дослідженні ультранизькі дози ФСГ та Р4 при пероральному вводенні зменшують наявність атрезії та послаблюють кістозні утворення, зберігаючи життєздатність великих антральних фолікулів. Наскільки нам відомо, механізм не є повністю дослідженим, навіть в той час як інше дослідження на морських свинках свідчить, що лікування ФСГ зменшує утворення кіст яєчників (60).

Таким чином, введенням ФСГP4 вдалося частково відновити фізіологічну структуру фолікулів яєчників, враховуючи як морфологічні, так і функціональні характеристики. Під час естрогенного циклу ФСГ стимулює проліферацію гранульозних клітн в первинних фолікулах, і коли фолікул досягає діаметру приблизно 150 мкм, ФСГ індукує утворення гранульозних клітин і активацію ароматази в гранульозних клітинах з поступовим збільшенням синтезу естрадіолу (61, 62). Крім того, наші результати додатково підтримують можливість призначення перорального ефективного лікування гонадотропіном.

Гонадотропін звичай вводять шляхом внутрішньом’язових, підшкірних або внутрішньовенних ін’єкцій через зменшену біологічну доступність перорального шляху введення, оскільки пептиди легко руйнуються і погано проникають через слизову кишечника (63, 64). Цікаво, що наші результати свідчать про те, що перорально введений ФСГ у поєднанні з P4 може знизити вираженість СПКЯ у гіперандрогенізованої моделі піддослідної миші. З іншого боку, малоймовірно, що інтактний ФСГ буде проникати з шлунково-кишкового тракту в кровообіг. Ідентифікація механізму, за яким діє перорально введений ФСГ, ще не з’ясована, що є обмеженням для цього дослідження. Однак, оскільки пероральний шлях введення був би найбільш зручним для пацієнтів, рекомендуються подальші дослідження.

 

Висновок 

В цілому, в цьому дослідженні було висвітлено ефект від введення наднизьких доз ФСГ в комбінації з Р4,піддослідним мишам. Наші результати показали, що лікування може зменшити несприятливість деяких особливостей СПКЯ, що вказує на новий та інтригуючий спосіб, з яким сліддетально ознайомитись.

 

Подяка

 Це дослідження не отримало конкретних грантів від фінансуючих агентств у державному, комерційному чи некомерційному секторах. GUNA S.P.A. внесли свій внесок у дослідження, фінансування від SKA FSH та SKA P4.